Interes Científico

  • Biolgogía Celular
  • Biología Molecular
  • Mecanismos de degeneración axonal y Sináptica
  • Neurodegeneración
  • Vias de Señalización Neuronal
  • Transporte Axonal
  • Motores Moleculares
  • Dinámica del Citoesqueleto

Patologías de Interés

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Neuropatías de Degeneración Retrógradas y el Transporte Axonal

Las neuronas son células altísimamente especializadas, moldeadas por millones de años de evolución de acuerdo a la función que desempeñan. Esta exquisita especialización les permite recibir, procesar, almacenar y transferir información óptimamente. En términos generales, las neuronas maduras tienen un cuerpo celular con diversas dendritas para recibir y procesar información, y un solo proceso axonal para la salida de la información a ser transmitida.

Las neuronas son particularmente vulnerables a problemas de transportes, debido a que al contrario del cuerpo celular y las dendritas, los axones no tienen la maquinaria de síntesis de proteínas. Todas las moléculas y organelas de membranas requeridas en los axones y sus sinapsis deben ser manufacturadas en el cuerpo cellular y enviadas a los compartimientos apropiados a travez de motores moleculares que se desplazan sobre microtúbulos (Kinesina y Dineína), los cuales son responsables del proceso neuronal conocido como transporte axonal rápido (FAT). Cabe mencionar que mutaciones puntuales que comprometen, pero no eliminan, la función de dichos motores, Kinesina-1 o Dineína citoplasmática, conllevan a neuropatías de degeneración retrógradas diferentes, paraplegia espástica (Reid, Kloos et al. 2002) y la enfermedad de neuronas motoras (Hafezparast, Klocke et al. 2003). Por lo tanto, estas evidencias biológicas señalan el rol central que juega el transporte axonal rápido en la función neuronal, la viabilidad y la neurodegeneración.

 Mecanismos Moleculares que Subyacen a la Alteración del Transporte Axonal Rápido en Neuropatías de Degeneracion Retrógradas

Datos experimentales de nuestro laboratorio, al igual que de otros han mostrado que existen deficiencias del transporte axonal rápido en numerosas enfermedades neurodegenerativas progresivas, incluyendo a las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Kennedy, Huntington, y  Creutzfeldt-Jakob o Vaca Loca (Pigino, Morfini et al. 2003, Morfini, Pigino et al. 2006, Serulle, Morfini et al. 2007, Morfini, You et al. 2009, Pigino, Morfini et al. 2009). Las deficiencias en el transporte axonal rápido se manifiesta en estadíos tempranos durante el desarrollo neuronal, precediendo la degeneración axonal y sináptica, así como de la muerte neuronal (Pigino, Morfini et al. 2003, Stokin, Lillo et al. 2005). Mutaciones en motores moleculares son muy poco frecuentes, generalmente letales a nivel embrionario, y ciertamente no asociadas a ninguna de las enfermedades neurodegenerativas mencionadas anteriormente. Entonces cabe preguntarse, cual es el la base molecular de la alteración del transporte axonal rápido en éstas neuropatías de aparición tardía? Nosotros proponemos que la deficiencia del transporte axonal rápido surge como consecuencia de una desregulación funcional de los motores causada por un desbalance de actividades fosfotransferasas (quinasas y fosfatasas), que como consecuencia afectan a ciertas propiedades funcionales de los motores moleculares, dando como resultado una alteración del transporte axonal rápido (Morfini, Burns et al. 2009). Si éstas alteraciones en la regulación del transporte axonal rápido llevan a un cambio sustancial  del mismo, la consecuencia final es la misma que la observada por alteraciones de los motores moleculares debido a mutaciones puntuales: alteración en el envío de material altamente importante hacia los axones y sus terminales sinápticos, lo cual desencadenaría una disfunción axonal y sináptica, falta de soporte neurotrófico y por última muerte neuronal.

La Proteína β-amiloide Oligomérica es un Potente Inhibidor del Transporte Axonal

Nuestro laboratorio ha mostrado recientemente que el beta amiloide, el péptico proteolítico derivado de la proteína precursora del amiloide (APP), en su conformación oligomérica (oAβ), inhibe el transporte axonal rápido mediante un mecanismo que involucra la activación de la proteína quinasa casein quinasa 2 (CK2) y la fosforilación aberrante de la proteína motora kinesina-1. La base molecular de la inhibición del transporte retrógrado todavía no ha sido determinado. La dramática inhibición del transporte axonal anterógrado inducida por oAβ predice una alteración de la neurotrasmisión. De hecho, la inyección de oAβ en la sinápsis gigante de calamar indujo una profunda inhibición de la transmisión sináptica (Moreno, Yu et al. 2009). Un análisis por microscopía electrónica sugirió que dicha inhibición resultó de una clara reducción en la disponibilidad de vesículas sinápticas en la zona activa, y de la falta de secreción de neurotrasmisores, consistente con la idea de que el oAβ inhibe el transporte anterógrado de vesículas sinápticas llevando neurotransmisores en su interior, componentes esenciales para la efectiva transmisión sináptica (Moreno, Yu et al. 2009). Más aún, análisis del transporte axonal retrógrado de la proteína BDNF en ratones que poseen la doble mutación sueca en el gen que codifica para la proteína APP, determinó una dramática reducción en el transporte de la proteína BDNF desde la periferia hacia el cuerpo celular (Poon, Blurton-Jones et al. 2009). Esta reducción de soporte trófico desencadenará eventualmente un evento de muerte celular programada o apoptosis (ver Figura 1).

Figura 1. Patrón de Degeneración Retrógrada. A) En el sistema nervioso intacto, las neuronas y sus blancos (ovales anaranjados) se correlacionan de una manera correcta. De esta forma, la actividad sináptica y el soporte neurotrófico (flechas verdes) están perfectamente coordinados. B) Cuando la actividad en alguna sinápsis es comprometida (por ejemplo: por una acumulación de oAβ, asterisco rosas, induciendo por ende una reducción del transporte axonal de componentes presinápticos), los terminales presinápticos se retraen, reduciendo así el retorno de neurotrofinas. Cambios en la expresión de genes puede ocurrir, pero el cuerpo celular y su núcleo están todavía intactos en este estadío. C) Cuando el número de sinapsis  funcionales cae por debajo del límite crítico, los terminales presinápticos remanentes son típicamente apagados y posteriormente retraídos. Como consecuencia, el suministro de neurotrofinas provenientes del órgano blanco no son suficientes para mantener el segmento distal del axon o mantener la viabilidad neuronal. D) A medida que el extremo distal del axon se atrofia, el núcleo neuronal empieza a exhibir las características clásicas de la muerte celular programada (apoptosis), las cuales incluyen núcleos picnóticos, achicamiento del cuerpo celular, deformaciones globosas  de las membranas celulares y marca de TUNEL, características exhibidas por las neuronas en los estadíos mas tardíos de la EA. El tiempo desde los cambios de la actividad sináptica mas tempranos observados en B, hasta la clara activación de las vías apoptóticas en D puede ser de meses o años. Esta figura fue modificada de (Brady and Morfini 2010),

Formas Patológicas de Tau Inhiben Selectivamente el Transporte Axonal Anterógrado 

La visión clásica de la función de la proteína Tau es la de proveer estabilidad dinámica a los microtúbulos (Wang, Yu et al. 1996, Conde and Caceres 2009). En años recientes, nuevas funciones han sido atribuídas a la proteína Tau incluyendo funciones de señalización (Morris, Maeda et al. 2011). Resultados obtenidos en colaboración con diversos laboratorios han demostrado que vías de señalización específicas inducidas por formas patológicas de la proteína Tau son capases de activar a la proteína fosfatasa PP1 (Kanaan, Pigino et al. 2012) dentro del compartimiento axonal. PP1 desfosforila el aminoácido serina 9 de la proteína quinas GSK3 β, dando como resultado su activación. La proteína GSK3β activa, fosforila a la proteína motora kinesina-1 en sus cadenas livianas, induciendo así la liberación del cargo que esta siendo transportado. De esta manera, el transporte anterógrado es inhibido específicamente sin afectar el transporte retrógrado. Experimentos de transporte vesicular en preparaciones de axoplasmas de calamar utilizando distintas variedades truncadas de Tau, nos permitieron identificar, que en los primeros 18 aminoácidos se encuentra una secuencia que tiene la capacidad de activar a PP1, el cual fue denominada secuencia PAD (Phospatase Activating Domain). La identificación de un dominio activador de PP1 nos permitió deducir que las formas patológicas de Tau inducen una reducción del transporte axonal via la exposición anormal de la secuencia PAD, la cual activa PP1, que  a su vez activa la proteína quinasa GSK3β, la cual induce la liberación del motor kinesina-1 de su cargo, via fosforilación de las cadenas livianas de kinesina-1 (Kanaan, Morfini et al. 2011, Kanaan, Morfini et al. 2011, Kanaan, Pigino et al. 2012).

Objetivos Futuros

Numerosas preguntas biológicas con importantes implicancias terapéuticas derivadas de nuestras evidencias experimentales necesitan ser respondidas, las cuales representan el motor que dirige nuestro esfuerzo investigativo. Cual es el mecanismo molecular por el cual beta amiloide oligomérico (oAβ) activa a la proteína quinasa casein quinasa 2 (CK2)? Cual es el mecanismo inhibitorio del transporte axonal tanto retrógrado como anterógrado inducido por CK2? Cual es el mecanismo molecular de la inhibición de la transmisión sináptica inducida por CK2 y oAβ? Que componentes axonales de membranas son específicamente inhibidos en su transporte por oAβ, Tau, α-sinucleína, toxina parkinsoniana MPP+, mutaciones de presenilina-1 (PS-1). Cual es la consecuencia funcional de la fosforilación de kinesina-1 y dineína por las proteínas quinasas CK2 y GSK3β? Que rol juega el citoesqueleto axonal en la inhibición del transporte axonal en la enfermedad de Alzheimer, Parkinson y Creutzfeldt-Jakob (enfermedad de la “vaca loca”)?

 Abordaje Experimental

 Para estudiar los mecanismos regulatorios del transporte axonal, tomaremos ventaja del uso de axoplasmas extruídos  aislados de calamar, Loligo pealei, un sistema experimental ex vivo único, el cual permitió tanto el descubrimiento del motor molecular anterógrado mas importante denominado Kinesina-1, como el entendimiento de numerosos eventos moleculares regulatorios del transporte axonal. Este sistema experimental ofrece la posibilidad única de explorar a tiempo real, propiedades bioquímicas de axones y motilidad vesicular sin interferencia de actividades dendríticas y/o somáticas. Para responder preguntas relacionadas al rol de proteínas patológicas sobre la actividad y transmisión sináptica, utilizaremos sinapsis gigantes de calamar, trabajando en colaboración con los Drs. Yuyu Song y Rodolfo Llinas en los Laboratorios de Biología Marina en Woods Hole, Massachusetts.

Para estudiar mecanismos subyacentes a la degeneración axonal y disfunción sináptica utilizaremos un abordaje experimental multidiciplinario, que incluye el uso de neuronas primarias corticales y de hipocampo derivadas de ratones trangénicos, modelo de diversas neuropatologías humanas incluyendo Alzheimer, Parkinson y Creutzfeldt-Jakob. Utilizaremos diferentes técnicas de miscroscpía experimental acopladas a cámaras microfluídicas de aislación para experimentos que requieran microscopía de time-lapse. Utilizaremos tejido humano post-mortem, fibroblastos humanos primarios de pacientes con diferentes neuropatologías, y también desarrollaremos neuronas primarias derivadas de células epiteliales humanas.

Subsidios

2011-2013. New Investigator Research Grant to Promote Diversity (NIRGD) Alzheimers Association. Mechanisms Underlying Oligomeric Abeta-inudced Axonal Transport Dysfunction. Role on grant: PI

2015-2017.  PIP. Mecanismo  molecular involucrado en el incremento de la  producción  del péptido Amiloide beta inducida por la deposición de Abeta: mecanismo patogénico de retroalimentación positiva en la enfermedad de Alzheimer. Role de la proteina quinasa PKC delta en la degeneracion axonal y sinaptica en la enfermedad de Parkinson. Director

2018-2020. PIP. Estudio de la relación entre regulación epigenética alterada de genes de memoria y pérdida de cholesterol como causa de problemas cognitivos asociados a la edad. Evalua los mecanismos por los cuales la perdida de colesterol durante el envejecimiento de neuronas hipocampales afecta la acetilación de histonas alterando la expresión de genes involucrados en el establecimiento de memoria. Co-Director

2019-2021. PRH-PIDRI. Mecanismo molecular asociado a la pérdida de conectividad sináptica en la enfermedad de Alzheimer: mecanismo patogénico del péptido amiloide β de 42 aminoácidos (Aβ-42). Rol del péptido amiloide β de 42 aminoácidos en la pérdida de conecciones sinápticas en neuronas afectadas por la enfermedad de Alzheimer. Director.

2018-2019. UNC-Primar-TP 2018-2021. Rol patológico del beta amiloide en la pérdida de conectividad sináptica en la enfermedad de alzheimer. Co-Director